Real Time PCR ile Kantitatif Analiz
Berna Türkmen - Moleküler Biyoloji ve Genetik, Haliç Üniversitesi
Real-time PCR, ışıma özelliğine sahip olan moleküllerin kullanılması ile PCR çalışma aşamasında izlenmesi ve miktar belirlenmesi yöntemidir. Real-time PCR, tek bir tüp kullanılarak DNA’nın çoğaltılmasını ve ürünlerini bir arada tutmayı kılar. Bu gelişme ile birlikte gen kopyası gerçekleştiğinde oluşan ürünlerin düzeylerini sayısal olarak bir değere dönüştürme sağlanmıştır. Bunun yanında Real-time PCR ile PCR çalışması devam ederken ekranda eşzamanlı izlemek ve PCR döngülerinin sayısına müdahale etmek mümkünleşmiştir.
Real-time PCR yapılırken kopya oluşmasını görünür hale getirmek için floresan işaretli problar ve boyalar kullanılır. Bu floresan ile DNA’nın oluşumu arasında bir doğru orantı vardır.
Real-time PCR; gen ekspresyon analizlerinde, hastalık teşhisinde, gıda testlerinde GDO miktar tayini gibi alanlarda kullanılmaktadır.
Real-time PCR ile amplifikasyon sonucu ürün varlığı 2 genel yöntem ile tespit edilir:
Özgül Olmayan Belirleme Sistemi-SYBR Green:
Çift zincirli DNA’ya bağlanan ‘SYBR Green’ yöntemindeki kullanılan floresan boya DNA miktarındaki artışa bağlı olarak ve real-time PCR cihazında floresan miktarı ne kadar okunuyorsa buna bağlı olarak eş zamanda artış gösterir. ‘SYBR Green’ en fazla kullanılan boya çeşiti olup 497 nm dalga boyunda yükseltgenme gösterirken 520 nm dalga boyunda indirgenme göstermektedir.
Burada kullanılan boya primerlerin bağlanıp uzama aşaması gerçekleştiğinde boya molekülü çift zincirli DNA’nın arasına girerek floresan yayılım başlatır. Floresan miktarının hızı arttıkça buradan anlaşılacak sonuç ürün miktarının arttığıdır. Bu artış real-time cihazının monitöründen izlenebilir.
Çoğaltmak istenilen DNA’nın ıstenilen bölge olup olmadığını DNA'nın erime eğrisi analizlerinin yapılması ile saptanabilir. Her bir DNA molekülünün kendine öz erime sıcaklığı derecesi bulunur. Bu erime sıcaklığının farklı olmasının nedeni DNA molekülünün uzunluğu ve içerdiği GC/AT oranına bağlı olarak değişir.
Özgül Belirleme Sistemi
TaqMan Probe Yöntemi:
Bu yöntemi içerenler, çoğaltılmak istenen DNA’ya komplementer olan ve floresan olarak işaretlenmiş tek zincirli proptur. Floresan ile işaretlenmiş olan tek zincirli probun 5’ ucunda ‘fluorophore’ ve 3’ ucunda ‘quencher’ bulunmaktadır. 3’ uçta bulunan TAMRA boyası 5’ uçta bulunan FAM boyasının sinyal oluşmamasını engellemek üzere görev görür.
Çoğaltma işlemi sırasında hedef olarak belirlenen nükleik asit dizisi üzerinde primerlerin bağlandığı bölgeler arasına TaqMan proplar bağlanır ve primerlerde bu işleme eşlik ettiğinde yeni zincir oluşumu başlar. Taq DNA Polimeraz enzimi 5’ ucundan 3’ ucuna probun bağlı olduğu bölgede FAM’ı probdan ayırır ve FAM böylelikle serbest kalarak sinyal oluşumu sağlar. Bu arada DNA zincir sentezi uzamaya devam ederken her bir döngüde ürün çoğalımı gerçekleşir ve bu ürün artışına bağlı olarak floresan artmaya başlar.
Moleküler Boncuk Yöntemi:
Bu yöntemin içeriğine bakıldığında saç tokası şeklinde bir yapı vardır ve bu yapının yuvarlak uç kısmı çoğaltılacak olan hedef DNA ile komplementer tek zincirli olan DNA dizisini içerir. 2 adet florokrom boya kullanılmaktadır ve bu boyalar yapının düz olan uç kısmında bulunmaktadır (Şekil 1). Prop olarak kullanılan moleküler boncuk probu solüsyon içerisinde serbest kaldığında ışıma gözlenmez. Kullanılan prob hedef DNA molekülüne göre tasarlanmış olup PCR ile çoğaltma aşamasında DNA ile karşılaştıklarında bir tür konformasyon değişikliğine uğrayıp düz, çift zincirli duruma geçiş yapar. Boyalar birbirlerinden uzaklaştıkça floresan miktarlarını artış gözlenir.
Şekil 1: Moleküler Boncuk Yönteminin Şematik Gösterimi
c.Hibridizasyon Prob Yöntemi:
Bu yöntemde iki farklı prop tasarlanmıştır ve bu tasarlanan probların 3’ ucunda floresan işaretli boya ve 5’ ucunda ise alıcı bir boya bulunmaktadır. PCR çalışma işleminde bu iki farklı prob hedef nükleik asit dizisine bağlanır ve birbirlerine yaklaştıklarında enerji yayılımı gerçekleşir. Enerji böylelikle floresan işaretli boyadan alıcı boyaya geçiş yapar. Bu geçiş işlemi sonucunda floresan miktarı ile PCR ile çalışılan süre doğrultusunda ürün miktarı doğru orantı olacak şekilde artar.
Şekil 2: Real-time PCR ile Amplifikasyon Sonucu SYBR Green, Hibridizasyon Prob, Taqman Prob Yöntemlerinin Şematik Gösterimi [https://www.gene-quantification.de/chemistry.html].
KAYNAKÇA:
Biogene. (2018). Hydrolysis probes. http://www.biogene.com/ApplicationNotes/Amplification/Methodology/Chemistries.htm (Erişim tarihi: 09.02.2022)
BIO-RAD. (2018). What is Real-Time PCR (qPCR)? http://www.bio-rad.com/en-tr/applications-technologies/what-real-time-pcr-qpcr?ID=LUSO4W8UU. (Erişim Tarihi: 09.02.2022)
Chiara A, Luisa C. (2017). A framework for understanding the roles of miRNAs in animal development. Development. 144:2548-2559.
Gulyaeva LF, Kushlinskiy NE. (2016). Regulatory mechanisms of microRNA expression. J Transl Med. 14(1):143.
Schmittgen TD, Lee EJ, Jiang J, Sarkar A, Yang L, Elton TS, Chen C. (2008). Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44(1):31-8.
ThermoFisher Scientific. (2018). Characterization of miRNA Expression in Normal Human Tissues. https://www.thermofisher.com/tr/en/home/references/ambion-tech-support/microrna-studies/tech-notes/characterization-of-mirna-expression-in-normal-human-tissues.html. (Erişim tarihi: 9.02.2022)
ThermoFisher Scientific. (2018). Getting Started with microRNA Expression Analysis Research using Real-Time PCR. https://www.thermofisher.com/tr/en/home/references/ambion-tech-support/microrna-studies/tech-notes/getting-started-with-microrna-expression-analysis-research-using.html (Erişim tarihi: 9.02.2022)
ThermoFisher Scientific. (2018). microRNA & Noncoding RNA Analysis Using Real-Time PCR. https://www.thermofisher.com/tr/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-applications/microrna-noncoding-rna-with-real-time-pcr.html (Erişim tarihi: 10.02.2022)
Yorumlar
Yorum Gönder